非無菌產品微生物限度檢查的改變

非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法

微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。 當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規定的微生物限度標準

時，應按下述規定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規定外， 本法不適用于活菌制劑的檢查。

本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代 方法等效于藥典規定的檢查方法。

微生物計數試驗應在受控潔凈環境環境潔凈度 10 000 級下的局部潔凈度不 低于 B100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防 止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、 工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的 測試方法》的現行國家標準進行監測。

如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和 劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。

供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。

計數方法 計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和zui可能數法（Most-Probable-Number

Method，簡稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計數時度較差，但對于某些微 生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。

供試品檢查時, 應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數 方法，同時所選的方法的供試品用量必須具備檢測充足樣品量的能力，能夠以保 證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規定。所選方法的適用性須經確 認。

計數培養基適用性檢查和計數方法適用性試驗 供試品微生物計數中所使用的培養基應進行適用性檢查。 供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合

于該產品的微生物計數。

若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，計數方法應重新進行適用

性試驗。

表 1   試驗菌液的制備和使用

注：當需用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌和酵母菌總數時，應進行培養基靈敏度檢查， 檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養基。

菌種及菌液制備

菌種  試驗用菌株的傳代次數不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌

種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學 特性。計數培養基適用性檢查和計數方法適用性試驗用菌株見表 1。

菌液制備 按表 1 規定程序培養各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管 內，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應在 2 小時內使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小時內使用。穩定的黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8℃，在驗證過的貯存期內使 用。

陰性對照 為確認試驗條件是否符合要求，應以稀釋劑代替供試品進行陰性對照試驗，

陰性對照試驗應無菌生長。供試品檢查時也需進行陰性對照試驗。如果陰性對照 有菌生長，應進行偏差調查。

培養基適用性檢查 微生物計數用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行

培養基適用性檢查。

按表 1 規定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨肉湯管或胰酪大豆胨 瓊脂平板培養基或沙氏葡萄糖瓊脂平板培養基，置表 1 規定條件下培養。每一試

驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進 行上述試驗。

被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在 0.5-2 范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致；被檢液體培養基 管與對照培養基管比較，試驗菌應生長良好。

計數方法適用性試驗

⒈供試液制備

根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液

制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過 45℃。供試液從制備至加入檢驗 用培養基,不得超過 1 小時。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應 建立其他適宜的方法。

⑴ 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。 若需要，調節供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

⑵ 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩 沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養基制備成 1:10 供試液。 分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供試品分散均勻。若需要，調節供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將 供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⑶  油脂類供試品  取供試品，加入經過濾除菌的十四烷酸異丙酯使溶解， 或與zui少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80 或其他無抑菌性的無菌表面活 性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40℃（特殊情況下，zui多不超過 45℃），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋劑使成 1∶10 供試液，保溫，混合，并在zui短時間內形成乳狀液。必要時，用含適宜濃度的無 菌聚山梨酯 80 或其他無抑制性無菌表面活性劑的稀釋劑進一步 10 倍系列稀釋。

⑷需用特殊方法制備供試液的供試品

膜劑供試品  取供試品,剪碎,加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養基，浸泡，振搖，制備成 1∶10 的供試液。 若需要，調節供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品，加入 pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于 腸溶制劑）或 pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑），置 45℃水浴中,振 搖,使溶解,制備成 1∶10 的供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

氣霧劑、噴霧劑供試品  取供試品,置冰凍室冷凍約 1 小時，取出，迅速消

毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器， 使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無菌容器中 混合，然后取樣檢查。

貼膏劑供試品 取供試品,去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑 料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏 劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山 梨脂 80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少 30 分鐘。必要時，用同一稀釋液

將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⒉  接種和稀釋 按下列要求進行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加

菌液的體積應不超過供試液體積的 1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應選擇zui低稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。

（1） 試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供試品對照組  取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操

作。

（3）菌液對照組   取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗

組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因導致所無法選擇采用zui低稀釋級 的供試液計數方法不能通過進行方法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液 進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用仍無法以其他方法消 除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適應 性試驗。

⒊  抗菌活性的去除或滅活 供試液接種后，按下列“微生物回收”規定的方法進行微生物計數。若試驗

組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與小于菌液對照組的比值不在 0.5-2 范 圍內菌數值的 50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。

⑴  增加稀釋液或培養基體積.

⑵  加入適宜的中和劑或滅活劑。

中和劑或滅活劑（表 2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 在稀釋劑或

培養基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設中和劑或滅活劑對照組， 即取相應量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒 性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值應在 0.5～2 范圍內。

表 2 常見干擾物的中和劑或滅活方法

⑶  采用薄膜過濾法。

⑷  上述幾種方法的聯合使用。 若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供

試品對該試驗菌具有抗菌活性，同時也表明供試品不可能被該類微生物污染。但 是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。 因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果 判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數方法適用 性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為zui低稀釋級的供 試液進行供試品檢查。

⒋  供試品中微生物的回收

表 1 所列的計數方法適用性試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。

微生物的回收可采用平皿計數法、薄膜過濾法或 MPN 法。

⑴ 平皿計數法 平皿計數法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗菌每種 培養基至少制備 2 個平皿，以算術均值作為計數結果。

傾注法   取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消 除”制備的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中, 注入 15～20ml 溫度不超過 45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。 若使用直徑較大的平皿，培養基的用量應相應增加。按表 1 規定條件培養、計數。 同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。

涂布法 取 15～20ml 溫度不超過 45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養基，注入直徑 90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養基用量也應相應增加。每一平皿表面 接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供 試液不少于 0.1ml。按表 1 規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液 對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。

⑵ 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于 0.45μ m,直徑一 般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時 應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適 宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前 先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應充分 干燥。為發揮濾膜的zui大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾 膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為 100ml。總沖洗量不得超過 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液適量（一般取相當于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌 數較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖 洗液沖洗濾膜。

若測定需氧菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上； 若測定霉菌和酵母總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上。按表 1 規定條件培養、計數。每株試驗菌每種培養基至少制備一張濾膜。同法測

定供試品對照組及菌液對照組菌數。

⑶  MPN 法  MPN 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數法，尤其 是用于霉菌計數，其結果是不可信的。因此，MPN 法僅在供試品需氧菌總數沒有 適宜計數方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數。若使用 MPN 法，按下列步 驟進行。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液至少 3 個連續稀釋級，每一稀釋級取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9～ 10ml 胰酪大豆胨肉湯培養基中，同法測定菌液對照組菌數。必要時可在培養基 中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管置 30～35℃培養 3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供 試品的原因使得結果難以判斷，可將該管培養物轉種至胰酪大豆胨肉湯培養基或 胰酪大豆胨瓊脂培養基，在相同條件下培養 1～2 天，觀察是否有微生物生長。 根據微生物生長的管數從表 3 查對被測供試品每 1g 或每 1ml 中總需氧菌的zui可 能數。

表 3 微生物zui可能數檢索表

注：表內所列檢驗量如改用 1g（或 ml）、0.1g（或 ml）和 0.01g（或 ml）時，表內數字應

相應降低 10 倍；如改用 0.01 g（或 ml）、0.001 g（或 ml）和 0.0001 g（或 ml）時，表 內數字應相應降低增加 10 倍，其余類推。

⒌  結果判斷 計數方法適用性試驗中，采用薄膜過濾法或平皿計數法時，試驗組菌落數減

去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在 0.5～2 范圍內；采 用 MPN 法，試驗組菌落數應在菌液對照組菌落數的 95%置信限內。若各試驗菌的 回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧 菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。

方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不 到要求,那么選擇回收zui接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

供試品檢查

檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或 cm2）。 除另有規定外,一般供試品的檢驗量為 10g 或 10ml；膜劑為 100cm2；貴重藥

品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時,應從 2 個以上zui小包裝單位中抽

取供試品,大蜜丸還不得少于 4 丸,膜劑還不得少于 4 片。 一般應隨機抽取供試品，取規定容器數，混合，取規定量供試品進行檢驗。 供試品的檢查 按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵

母菌總數的測定。 胰酪大豆胨瓊脂培養基用于測定需氧菌總數；沙氏葡萄糖瓊脂培養基用于測

定霉菌和酵母菌總數。

陰性對照試驗  以稀釋劑代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無 菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

⒈ 平皿計數法 平皿計數法包括傾注法和涂布法。除另有規定外，取規定量供試品，按方法

適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制 備 2 個平皿。

培養和計數  除另有規定外，胰酪大豆胨瓊脂平板在 30～35℃培養 3-5 天， 沙氏葡萄糖瓊脂平板在 20～25℃培養 5-7 天， 觀察菌落生長情況,點計平板上 生長的所有菌落數并報告。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數。點計菌落數后， 計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個 平皿的菌落數平均值不小于 15，則兩個平皿的菌落數不能相差 1 倍或以上。

菌數報告規則  需氧菌總數測定宜選取平均菌落數小于 300cfu 的稀釋級、 霉菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌落數小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數報告

（取兩位有效數字）的依據。取zui高的平均菌落數，計算 1g、1ml 或 10cm2 供試 品中所含的微生物數。

如各稀釋級的平皿均無菌落生長，或僅zui低稀釋級的平板有菌落生長，但 平均菌落數小于 1 時，以﹤1 乘以zui低稀釋倍數的值報告菌數。

⒉  薄膜過濾法

除另有規定外，按計數方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當

于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的供試液，若供試品所含的菌數較多時，可取適宜稀 釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖 洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培 養基上培養。

培養和計數 培養條件和計數方法同平皿計數法，每張濾膜上的菌落數應不 超過 100cfu。

菌數報告規則 以相當于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾 膜上無菌落生長，以﹤1 報告菌數（每張濾膜過濾 1g、1ml 或 10cm2 供試品）, 或﹤1 乘以zui低稀釋倍數的值報告菌數。

⒊  MPN 法 取規定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和供試品接

種，所有試驗管在 30～35℃培養 3～5 天，如果需要確認是否有微生物生長，按 方法適應性試驗確定的方法進行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數，從表 3 查對每 1g 或 1ml 供試品中需氧菌總數的zui可能數。

結果判斷 需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數（包括真菌菌落

數）；霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數（包括細 菌菌落數）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數結 果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄 糖瓊脂培養基或選擇性培養基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養基）進行霉菌和酵母菌總數 測定。使用選擇性培養基時，應進行培養基適用性檢查。若采用 MPN 法，測定結 果為需氧菌總數。

各品種項下要求執行規定的微生物限度標準解釋如下： 101cfu：  可接受的zui大限度菌數為 20；

102cfu：  可接受的zui大限度菌數為 200；

103cfu：  允許可接受的zui大限度菌數為 2000：依此類推。 若供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查結果均符合該品種項下的

規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品

不符合規定。

稀釋液、沖洗液及培養基

見非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查